活體動物體內(nèi)成像技術(shù)是指應(yīng)用影像學方法，對活體狀態(tài)下的生物過程進行組織、細胞和分子水平的定性和定量研究的技術(shù)?；铙w動物體內(nèi)成像技術(shù)主要分為可見光成像 (optical imaging)、核素成像（radio-nuclear imaging）、核磁共振（magnetic resonance imaging ，MRI）成像和超聲（ultrasound）成像、計算機斷層攝影（computed tomography ，CT）成像五大類，其中可見光成像和核素成像特別適合研究分子、代謝和生理學事件，通常稱為功能成像；超聲成像和CT則適合于解剖學成像，通常稱為結(jié)構(gòu)成像。ELISA試劑盒
功能成像與結(jié)構(gòu)成像比較，前者更能夠反映細胞或基因表達的空間和時間分布，從而了解活體動物體內(nèi)的相關(guān)生物學過程、特異性基因功能和相互作用。所以，活體動物體內(nèi)功能成像技術(shù)可用于觀察和追蹤靶細胞、基因的表達，同時檢測多種分子事件，優(yōu)化藥物和基因治療方案，從分子和細胞水平對藥物療效進行觀察，從整體動物水平上評估疾病發(fā)展過程，對同一個動物進行時間、環(huán)境、發(fā)展和治療影響跟蹤。由于功能成像的諸多優(yōu)勢，這項技術(shù)廣泛應(yīng)用于生命科學、醫(yī)學研究及藥物開發(fā)等方面，本文重點介紹活體動物可見光成像技術(shù)。
體內(nèi)可見光成像(optical in vivo imaging)技術(shù)主要包括生物發(fā)光(bioluminescence)與熒光(fluorescence)成像兩種技術(shù)。生物發(fā)光成像是用熒光素酶(luciferase)基因標記細胞或DNA，利用其產(chǎn)生的蛋白酶與相應(yīng)底物發(fā)生生化反應(yīng)產(chǎn)生生物體內(nèi)的探針光信號；而熒光成像則是采用熒光報告基因（如GFP、RFP）或Cyt及dyes等熒光染料進行標記，利用熒光蛋白或染料產(chǎn)生的熒光就可以形成體內(nèi)的熒光光源。前者是動物體內(nèi)的自發(fā)光，不需要激發(fā)光源，可通過高度靈敏的CCD直接捕捉光信號，而后者則需要外界激發(fā)光源的激發(fā)才可以捕捉發(fā)光信號。傳統(tǒng)的動物實驗方法需要在不同的時間點宰殺實驗動物以獲得數(shù)據(jù), 得到多個時間點的實驗結(jié)果。相比之下，體內(nèi)可見光成像技術(shù)通過對同一組實驗對象在不同時間點進行記錄，跟蹤同一觀察目標（標記細胞及基因）的移動及變化，所得的數(shù)據(jù)也更加真實可信。另外, 這一技術(shù)由于不涉及放射性物質(zhì)，具有操作簡單，所得結(jié)果直觀，靈敏度高等特點, 在剛剛發(fā)展起來的幾年時間內(nèi)，已廣泛應(yīng)用于生命科學、醫(yī)學研究及藥物開發(fā)等方面。
一、活體生物發(fā)光成像技術(shù)
（一）技術(shù)原理
1. 標記原理
哺乳動物生物發(fā)光，一般是將Firefly luciferase基因（由554個氨基酸構(gòu)成，約50KD）即熒光素酶基因整合到預(yù)期觀察的細胞染色體DNA上以表達熒光素酶，培養(yǎng)出能穩(wěn)定表達熒光素酶的細胞株，當細胞分裂、轉(zhuǎn)移、分化時, 熒光素酶也會得到持續(xù)穩(wěn)定的表達。基因、細胞和活體動物都可被熒光素酶基因標記。將標記好的細胞接種到實驗動物體內(nèi)后，當外源（腹腔或靜脈注射）給予其底物熒光素(luciferin)，即可在幾分鐘內(nèi)產(chǎn)生發(fā)光現(xiàn)象。這種酶在ATP，氧存在的條件下，催化熒光素的氧化反應(yīng)才可以發(fā)光，因此只有在活細胞內(nèi)才會產(chǎn)生發(fā)光現(xiàn)象，并且發(fā)光光強度與標記細胞的數(shù)目線性相關(guān)。ELISA試劑盒
除Firefly Luciferase外，有時也會用到Renilla Luciferase。二者的底物不一樣，前者的底物是熒光素（D-luciferin），后者的底物是coelentarizine。二者的發(fā)光波長不一樣，前者所發(fā)的光波長在540~600nm，后者所發(fā)的光波長在460~540nm左右。前者所發(fā)的光更容易透過組織，后者在體內(nèi)的代謝比前者快，而且特異性沒有前者好，所以大部分活體實驗使用Firefly Luciferase作為報告基因，如果需要雙標記，也可采用后者作為備選方案。
熒光素酶的發(fā)光是生物發(fā)光，不需要激發(fā)光，但需要底物熒光素。熒光素在氧氣、ATP存在的條件下和熒光素酶發(fā)生反應(yīng)，生成氧化熒光素(oxyluciferin)，并產(chǎn)生發(fā)光現(xiàn)象。
對于細菌標記，一般利用發(fā)光酶基因操縱子luxABCDE或luxCDABE，其由控制的編碼熒光素酶的基因和編碼熒光素酶底物合成酶的基因組成。利用這種辦法進行標記的細菌會持續(xù)發(fā)光，不需要外源性底物。但是一般細菌標記需要轉(zhuǎn)座子的幫助把外源基因插入到細菌染色體內(nèi)穩(wěn)定表達。
2. 底物熒光素的特點
熒光素由于諸多優(yōu)點得到廣大科研人員的青睞，主要特點如下：
(1) 熒光素不會影響動物的正常生理功能。
(2)熒光素是280道爾頓的小分子，水溶性和脂溶性都非常好，很容易穿透細胞膜和血腦屏障。
(3) 熒光素在體內(nèi)擴散速度快，可通過腹腔注射或尾部靜脈注射進入動物體內(nèi)。腹腔注射擴散較慢，持續(xù)發(fā)光長。熒光素腹腔注射老鼠后約1min后表達熒光素酶的細胞開始發(fā)光，10min后強度達到穩(wěn)定的zui高點，在zui高點持續(xù)約20~30 min后開始衰減，約3h后熒光素排除，發(fā)光全部消失，*檢測時間是在注射后15~35min之間；若進行熒光素靜脈注射，擴散快，但發(fā)光持續(xù)時間很短?？蒲腥藛T根據(jù)大量的實驗總結(jié)出熒光素的合適的用量是150mg/kg，即體重20克的小鼠需要3毫克的熒光素。
(4) 觀察時間的間隔沒有zui短限制，只要觀察的條件控制一致就可以。雖然底物在動物體內(nèi)有一定的代謝過程，但是上一次底物的殘留曲線可以知道，可以控制對下一次觀察結(jié)果的影響。
3. 光學原理
光在哺乳動物組織內(nèi)傳播時會被散射和吸收，光子遇到細胞膜和細胞質(zhì)時會發(fā)生折射現(xiàn)象，而且不同類型的細胞和組織吸收光子的特性并不一樣。血紅蛋白（hemoglobin）是造成體內(nèi)可見光被吸收的主要因素，其吸收可見光中藍綠光波段的大部分。但是在可見光大于600納米的紅光波段，血紅蛋白的吸收作用卻很小。因此，在偏紅光區(qū)域, 大量的光可以穿過組織和皮膚而被檢測到。利用活體動物生物發(fā)光成像技術(shù)zui少可以檢測到皮下的幾百個細胞。當然，由于發(fā)光源在老鼠體內(nèi)深度的不同可看到的zui少細胞數(shù)是不同的。一般認為，每一厘米深度，發(fā)光強度衰減10倍，血液豐富的組織或器官（比如心臟、肝臟、肺臟）衰減多，與骨骼相鄰的組織或器官衰減少。在相同的深度情況下，檢測到的發(fā)光強度和細胞的數(shù)量具有非常好的線性關(guān)系，可由儀器量化檢測到的光強度，反映出細胞的數(shù)量。
（二）活體生物發(fā)光成像技術(shù)應(yīng)用領(lǐng)域
活體生物發(fā)光成像技術(shù)是一項在某些領(lǐng)域有不可替代優(yōu)勢的技術(shù)，比如腫瘤轉(zhuǎn)移研究、藥物開發(fā)、基因治療、干細胞示蹤等方面。
1．腫瘤學
活體生物發(fā)光成像技術(shù)能夠讓研究人員能夠直接快速的測量各種癌癥模型中腫瘤的生長、轉(zhuǎn)移以及對藥物的反應(yīng)。其特點是*的靈敏度使微小的腫瘤病灶（少到幾百個細胞）也可以被檢測到，比傳統(tǒng)方法的靈敏度大大提高了；非常適合于腫瘤體內(nèi)生長的定量分析；避免由于宰殺老鼠而造成的組間差異；節(jié)省動物成本。由于以上特點，使基于轉(zhuǎn)移模型、原位模型、自發(fā)腫瘤模型等方面的腫瘤學研究得到發(fā)展。建立腫瘤轉(zhuǎn)移模型，可以觀察腫瘤轉(zhuǎn)移情況，進一步探討腫瘤轉(zhuǎn)移的機制；可進行原位接種，觀察原位以及原位轉(zhuǎn)移模型，使腫瘤學研究更接近腫瘤臨床發(fā)病的微觀環(huán)境；通過建立自發(fā)腫瘤模型，可以觀察腫瘤發(fā)生機理。ELISA試劑盒
在線客服
